【材料】

1．组织来源手术切除人的正常肺组织。

2．培养用试剂

(1)TE液：TE液含Tyrode液和2mmol/L EDTA,Tyrode液含 137mmo1/L NaCl,0.36mmol/L  NaH₂P0₄,5.55mmol/L葡萄糖和2.7 mmol/L KC1。

(2) TEA液：TE液中含有200 ug/ml氨苄西林、200ug/ml庆大霉素和40ug/ml甲硝唑。

(3) TGMD液：Tyrode液，含0.1％明胶、15mg/L DNA酶和1.23mmol/L MgC1₂。

(4) HA液：HEPES液补充0.25g/L不含脂肪酸的BSA, HEPES液含20mmol/L HEPES,5mmo1/L KC1,125mmol/L NaCl和0.5mmol/L葡萄糖。

(5) HACM液：HA液补充1 mmol/L MgCl,和1 mmol/L CaC1₂。

(6)消化液a用TE液配成，含有0.75g/L木瓜凝乳蛋白酶和3 g/L链霉蛋白酶。

(7)消化液b用TGMD液配成，含有0.15g/L弹性蛋白酶和1.5g/L胶原酶。

(8) Percoll溶液：配成密度为1.090g/ml,1.080g/ml, 1.070g/ml和1.062g/ml的4种溶液。

3.培养基配方和制备RPMI 1640，含有10% FBS,0.1mmol/L非必需氨基酸、50ug/L SCF,2mmo1/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100 ug/ml链霉素。调整pH为7.2。

4．实验器材止血钳、手术刀、解剖剪和解剖镊。

【方法】

1．取材取手术切除的肺组织10～40g，放入4℃的TEA液中，剥除血管和支气管后，将肺组织切成大小约为0.2～lg的小块，用TEA液冲洗2次。

2．消化将肺组织剪碎，加入消化液a，在室温条件下消化20分钟。用300 um孔径的不锈钢筛网滤去已脱落下来的细胞。然后用TE液清洗组织块，加入消化液a，将组织块重复消化20分钟和过滤1次。再用TGMD液清洗组织块后，加入消化液b，在30℃条件下消化20分钟。

3．分离细胞用300 um孔径的不锈钢筛网滤出组织块，收集滤液，在4℃条件下进行1000r/min离心10分钟。吸去上清液，用HA液混悬沉淀细胞，在4℃条件下保存。重复操作1次，得到细胞悬液。将两次的细胞悬液混合，用100um孔径的不锈钢筛网过滤，收集滤液，在4℃条件下进行1000r/min离心10分钟。然后，用4℃的HA液混悬沉淀细胞，再离心1次（1000r/min，10分钟）。

4．接种与培养用HACM液混悬细胞，进行细胞计数，调整细胞密度为（0.5～2)x10⁶个／ml。在50ml离心管中依次缓慢滴入密度为1.090g/ml, 1.080g/ml,1.070g/ml和1.062g/ml的4种Percoll溶液。在1.062g/ml的Percoll溶液中预先混入约1x10⁷个细胞。然后，在20℃条件下进行1000r/min离心40分钟。在密度1.070与1.080,1.080与1.090两个Percoll溶液界面处收集细胞，再用HA液混悬细胞，在4℃条件下离心进行1000r/min离心10分钟，然后重复离心1次。用培养液混悬沉淀细胞，进行细胞计数，调整细胞密度为(0.5～2)x10⁶个／ml，放培养箱中培养。24小时后更换培养液，以后每周换液1次。

【结果】

消化后取到的有核细胞中，4％～14％为肥大细胞。细胞呈圆形或卵圆形，细胞质中充满大小一致的颗粒，均匀分布在核周围。经Percoll溶液处理得到的细胞中，肥大细胞可达99%。

【注意事项】

1．为了保持细胞活力，在离心次数较多的肥大细胞的分离和纯化过程中，应尽量保证离心温度。

2．向离心管加入Percoll溶液时要慢而轻，以免破坏密度梯度，影响肥大细胞的纯化。