北京普天同创生物科技有限公司
【材料】
1.组织来源1~2月龄杂种猪(5~10kg),雌雄不限。
2.培养基DMEM无血清培养基。
3.试剂胰岛素、胰高血糖素、转铁蛋白、氢化可的松、I型胶原酶、鼠尾胶原、肝素、注射用头孢他啶等。
4.肝脏灌注液见表4-3 。
5. 24孔培养板、手术器械、150 um ,100 um ,80 um尼龙滤网、灌注蠕动泵、离心机等。
【方法】
1.猪与实验前12小时开始禁食,术前备皮。按50mg/kg体重腹腔内注射30g/L戊巴比妥钠,待麻醉生效后,消毒腹部皮肤,打开腹腔,暴露门静脉及下腔静脉,于下腔静脉内注射125U肝素。
2.分离门静脉和下腔静脉,门静脉分离后,分别行近心端和远心端插管固定,近心端供肝脏灌注用,远心端供抽取门静脉血用,每3~5分钟抽吸1次,每次尽量抽吸干净。分别结扎其远心端、近心端插管并固定,在肝静脉上端结扎下腔静脉。
3. 37℃水浴预热肝脏灌注液,经门静脉、下腔静脉循环灌注I,Ⅱ灌注液,蠕动泵灌注速度50~60ml/min,灌注20分钟左右,至肝脏变为苍白或黄白色。
4.摘取消化充分的肝脏,切开肝包膜,将消化分离的肝细胞悬液收集到37℃预热的灌注液Ⅲ中,分别经150um,100um, 80um滤网过滤,制备成粗制的肝细胞悬液。然后经1000r/min离心5分钟,以洗除灌注液Ⅱ中的消化液,共离心3次,将最后一次离心的肝细胞沉淀加入灌注液N,制备成肝细胞悬液。
5.肝细胞培养将肝细胞悬液移至DMEM无血清培养基中培养。取猪肝细胞悬液1ml(全肝细胞的细胞浓度为3x105个),接种于已经铺好鼠尾胶原的24孔培养板中,并加2ml含有100 ug/L胰岛素、100ug/L胰高血糖素、100 ug/L转铁蛋白、200 ug/L氢化可的松、200 ug/L头抱他啶的DMEM无血清培养基中,置37℃, 5 % C02孵箱中培养,24小时后去除培养上清液,用少量培养液冲洗培养细胞孔,加入3 ml含有上述各种因子的DMEM无血清培养液继续培养。此后要定期进行换液:每次换取新鲜培养液1 ml。
【结果】
1.分离所得的肝细胞在悬液中能存活4~6小时,可用于短时间的试验,可根据细胞良好的折光形态及锥虫蓝(0.2%)染色排斥试验确认细胞的活力。
2.培养的肝细胞呈三角形、圆形或类圆形,细胞界限清晰,排列整齐,细胞质丰富、透亮,细胞核有单核、双核,呈圆形或椭圆形,核仁清晰可见。肝细胞可分泌白蛋白,随着培养天数的增加,分泌量也增加,至培养9天时达峰值,随后又逐渐下降。
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