北京普天同创生物科技有限公司
一、鸡胚成纤维细胞的制备和培养
成纤维细胞是最易培养的细胞,细胞呈典型的梭形,生长方式受到密度的限制,通常在培养液中只有约50代的相对有限的生命周期,细胞能释放许多因子,如I型胶原,它可作为该类细胞的标记物。成纤维细胞或成纤维细胞样细胞已广泛应用于细胞结构的研究,其良好的耐受性使之易于进行从基因转染到微注射等较多领域的研究。
【材料】
1.组织来源 孵育9~11日龄鸡胚2只。
2.培养基 MEM培养液,含10%小牛血清(CS)的完全MEM培养液。
3.培养用试剂 无钙镁Hanks(CMF-Hanks)液、0.25%胰酶用CMF-PBS配制等。
4.器皿与仪器 各种吸管、离心管、60mm平皿、培养瓶、三角烧瓶、100目尼龙滤网或不锈钢滤网、镊子、眼科小剪、细胞计数器一套、显微镜、0.3%锥虫蓝等。
【方法】
1.取胚取9~11日龄鸡胚于蛋架上,用碘酊、乙醇消毒气室部,用剪刀去除气室部蛋壳,用无菌弯头小镊钩住鸡胚的颈部,并轻轻取出鸡胚于无菌平皿中。
2.组织处理将鸡胚头、爪、内脏去除,留下的鸡胚组织用CMF-Hanks液洗2次,以除去红细胞,然后将鸡胚组织移入小三角烧瓶内,用剪刀剪碎成1 mm3大小组织块,用Hanks液洗2次。
3.胰酶消化将洗液上清吸弃,根据沉下鸡胚组织块的多少,加入10倍量的0.25%胰酶(pH 7.4),置37℃水浴中消化15~30分钟,视其组织碎块聚合成一团并沉于瓶底,聚集块的表面呈毛样模糊时即可。取出烧瓶后用毛细管轻轻吸出消化液,用CMF-Hanks液轻轻漂洗1~3次,加10m1 MEM培养液(不加血清),用吸管反复吹打,使细胞分散,然后将分散好的细胞悬液通过不锈钢筛网,补齐10% CS或加10%的胎牛血清(FBS)。
4.细胞计数与分装取上述获得的单细胞悬液少量,进行1:5或1:10稀释后计数,另取l ml稀释液加1小滴0.3%锥虫蓝,待1分钟后进行细胞活性检测,细胞活性率在90%以上者,说明细胞可以接种培养。然后用含10% CS的完全MEM培养液调至细胞浓度为(0.5~1)x106/ml,分装培养瓶内。待细胞培养有一定经验后,可省略细胞计数步骤,而凭经验估计细胞浓度,如一只10日龄鸡胚制成10ml细胞悬液时细胞数约为4x106/ml,也可视其悬液的透明度来估计。
【结果】
将上述培养物置37℃孵箱内培养,逐日观察细胞生长情况,一般细胞于接种4~6小时可以贴壁,于2~3天可长成单层细胞,换维持液后即可用于试验,或经传代后再长成单层时使用。
【注意要点】
成纤维细胞比较容易培养,培养中注意消化贴壁细胞的时间不宜过长,以免损伤细胞。
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