通过核酸和磷酸钙以共沉淀物颗粒形式出现时，形成磷酸钙-DNA沉淀物，使之黏附到培养细胞表面，利于细胞吞入、摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞。而进入细胞的DNA仅有1％～5％可进入细胞核内，其中仅有不到1％的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达。影响磷酸钙转染法转染效率的主要因素是沉淀中DNA的量，沉淀停留在细胞上的时间长短，以及是否用甘油或二甲基亚砜(DMSO）冲击，及冲击时间的长短。总的来说，磷酸钙转染中要用较高浓度的DNA(1～50ng)。用磷酸钙介导的转染中，沉淀中DNA的总浓度对于DNA的摄取效率有极大的影响。对于某些细胞系，当在l0cm平皿中加入的DNA多于10～15 ug时，就会导致细胞过多死亡以及很少的DNA摄入。但对于其他细胞类型，如原代细胞，沉淀中需要有高浓度的DNA，才能使DNA进入细胞。

DNA一磷酸钙沉淀在细胞上停留的最适时间随细胞类型不同而有所差别。此外甘油或二甲基亚砜冲击可极大地提高某些细胞类型的转染效率。本节主要介绍两种磷酸钙转染方法：

【材料】

1.2 x HEPES缓冲盐溶液（HeBS)280mmol/L NaCl,10mmol/L KCI,l.5mmo1/L Na2 HPO₄·2H₂0,12mmol/L葡萄糖、50mmol/L HEPES。

将1.63g NaCl,0.074gKC1,0.027g Na₂HPO₄·2H₂0,0.2g葡萄糖，1.19g Hepes溶解于90ml双蒸水，用0.5mmo1/L NaHC0₃调pH为7.1，然后用蒸馏水定容l00ml。检测转化效率，用0.22 um的硝酸纤维素膜过滤除菌，分装，-20℃保存。

2. 2 x BES缓冲液（BBS) 50mmol/L N,N-双（2-羟乙基）2-氨基乙磺酸（BES),280mmo1/L NaCl,l.5mmo1/L Na₂HPO₄(pH 6.95）。

将1.07g BES,1.6g NaCl,0.027g Na₂HPO₄·2H₂0溶于总体积90ml的双蒸水中。在室温下用HCl将溶液的pH调至6.96，然后用双蒸水将体积调至l00ml。用0.22 um的硝酸纤维素膜过滤除菌，贮存于-20℃（可以反复冻融）。

3. 2mo1/L CaCl₂将10.8g CaCl₂·6H₂0溶于20ml双蒸水，用0.22um的硝酸纤维素膜过滤除菌，按每小瓶1 ml分装，冻存于-20℃。

4. TElmmol/L Tris-HC1,0.lmmol/L EDTA(pH 8.0）。

5. DNA溶液将需要转染的DNA用乙醇沉淀（10～50ug/cm平板），空气中晾干。将沉淀DNA重悬于TE液中（浓度为0.5～1.0ug/ml) 0 4℃保存。

6. 0.1 mol/L PBSNaCl 8g, KCl 0.2g, Na₂HPO₄·12 H₂0 1.44g,KH₂P0₄ 0.4g加水至l000ml，用0.22 um或0.45 um的硝酸纤维素膜过滤除菌，4℃保存备用。

7. G418（新霉素G418）液 将1g G418溶于1 mmol/L HEPES缓冲液中，加双蒸水10ml，过滤除菌，4℃保存备用。

8. G418选择性培养基用含10％胎牛血清的DMEM培养基配制，G418的浓度为200～800mg/L。

9．其他试剂0.25%胰蛋白酶等。

【方法】

1．利用HEPES缓冲溶液系统的磷酸钙转染法将HEPES缓冲盐溶液与含有氯化钙及DNA的溶液缓慢混合，可形成含磷酸钙和DNA的沉淀，然后直接吸附于细胞的表面，通过不明机制将外源DNA导入细胞内。

(1)供体DNA制备：将需要转染的DNA用乙醇沉淀，空气中晾干，然后将沉淀DNA溶于TE中（浓度为40mg/L)。4℃保存。

(2）受体细胞的培养：研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。如小鼠BALB/c3T3或NIH3T3细胞系等，该细胞有一定自发转化倾向。细胞一般于转染前24小时传代，吸去旧培养基，加2～3 ml 0.25%胰蛋白酶于室温下消化3～5小时。当在显微镜下观察细胞皱缩变圆时，吸去消化液，加入含10％胎牛血清的DMEM完全培养基，用吸管轻轻吹打细胞，使细胞悬浮后接种，接种密度为2x10⁴个／cm²，置37℃ ,5% C0₂孵箱培养，待细胞生长达50％～75％瓶底面积时即可进行转染。

(3) DNA-磷酸钙沉淀物的制备

1)将供体细胞DNA和PSV2-neo质粒DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同时向供体细胞DNA溶液200ul中加入带新霉素基因的质粒DNA溶液（20mg/L) 220ul和 2xHEPES液250u1(PSV2-neo为1～2mg/L)；

2）取500 u1上述DNA溶液加入硅化试管中，在振动下缓慢加入3.lml 2mol/L CaCl2（约需30秒加完）,充分混匀。

3)然后立即混旋，室温下静置试管，约5分钟出现轻度混浊，浊度越来越浓，大约在20～30分钟时，出现细小颗粒，经吹打后即可进行转染受体细胞。

(4）转染受体细胞：待转染的受体细胞培养于25 ml培养瓶内。

1)在转染前4小时将处于对数生长期的受体细胞更换一次新鲜培养液，每瓶加培养液5 ml；

2)充分混匀DNA-磷酸钙沉淀，取0.5m1加入待转化细胞的培养基中，轻轻地摇动，使其均匀；或除去培养瓶内的培养基，取0.5 ml DNA沉淀液逐滴加到细胞表面，室温下静置20～30分钟，然后再加入5 ml完全培养基。此时培养液变为橘黄色，置37℃,5% CO₂孵箱培养24小时或更长，使细胞充分吸入DNA-磷酸钙结晶颗粒；

3)除去培养液，用5ml PBS洗细胞2次，更换5 ml完全培养液，继续培养细胞24小时，诱导转染基因的表达；

4）稳定转化克隆的筛选：更换浓度为800mg/L的G418选择性培养基进行筛选。同时要设置未能转染的对照组细胞；

5)培养需要3～5天，对照细胞大部分死亡，这时转染细胞更换浓度为200mg/L的G418选择性培养基，每3～4天更换一次选择性培养基；

6) 2周后对照细胞死亡，在转染的细胞瓶中可见有抗药性的细胞克隆出现，即呈岛状的细胞克隆生长。待其增大后再进行克隆化和扩大培养，可建立转化细胞株，并作进一步鉴定。

(5）在显微镜下选出生长状态良好的细胞克隆。将旧培养基弃去，加胰蛋白酶消化液消化5分钟（消化时间视其细胞的不同有所变化），吸去消化液。用吸管首先吸少许培养基，对准欲挑选的细胞克隆，轻轻吹吸3～5次，将其转入24孔板内，如此反复2～3次，尽量将细胞克隆的所有细胞都吸出。待孔底长满细胞后，转入较大的培养瓶内扩大培养。当细胞长至足够量（107～108）时即可进行DNA,RNA的杂交分析和表达蛋白质的检测。

2．利用BES缓冲溶液系统的磷酸钙转染法将细胞置于35℃,3％的C0₂条件下培养15～24小时，在此过程中缓慢形成DNA磷酸钙复合物，从而将外源DNA导入细胞。用这种方法，10％～50％的细胞可稳定地整合和表达转染的DNA.

（1)细胞转染前准备好贴壁细胞（50％～75％细胞融合）。

(2）质粒DNA：用TE缓冲液将质粒DNA稀释至1ug/ml,4℃保存。所用的质粒DNA可分别用10,20,30ug质粒DNA转染3个平皿的细胞，培养过夜来决定最适DNA量。用10x10放大倍数的显微镜检查平皿，DNA浓度合适时将形成均匀的颗粒状沉淀，DNA浓度太低会形成粗糙的丛状颗粒,DNA浓度太高会形成几乎看不见的细小沉淀。

(3）将最适量的质粒DNA与500ul 0.25mol/L CaCl2混合，加入500ul 2xBES中，混匀，室温下孵育10～20分钟。

(4）将CaCl₂-DNA溶液逐滴加入细胞中，同时晃动平皿。在35℃,3% C02培养箱中培养15～24小时。（注意：C0₂的浓度很关键。在培养细胞之前用Fyrite气体分析仪检测C0₂的百分含量。）

(5)用5ml PBS洗细胞2次，加入10ml完全培养液。对于稳定转化，在35～37℃,5% C0₂培养箱中培养24小时；对于瞬时表达，培养48～72小时。

(6)在开始选择培养前，稳定的转化细胞按1：10至1：30传代。于35～37℃,5% CO₂培养箱内培养过夜。

(7）选择培养：将培养液换成选择培养液，或在适当的选择条件下培养细胞。

【注意事项】

1．为了获得高转化效率，质粒DNA应该用氯化艳密度梯度离心，进行纯化2次，不纯的DNA会影响转染效率，超螺旋状态的DNA转染的效果好。如果用于转化的DNA量比较小，可加介导DNA (carrier DNA)。一般用鲑鱼精子（salmon sperm) DNA作为介导DNA。

2．利用HEPES缓冲溶液系统的磷酸钙转染法该法的关键是2xHEPES缓冲盐溶液必须是新鲜配制的，同时2.5mol/L的CaC12溶液也应该是新鲜配制的。该溶液的pH是实验成功的关键，其最适的pH范围是7.05～7.12。偏酸时不形成颗粒，偏碱时则形成大块状颗粒，这两种情况均导致转染失败。所以一定要预先调节HEPES液的pH（用1.Omol/L NaOH调节）。此外每批配制的2 x HEPES溶液其转化效率是不一样的，因此对于每批配制的2xHEPES溶液都应该检查其转化效率。其初步的检测方法是将0.5 ml 2 x HEPES溶液与0.5 ml250mmol/L CaC1₂溶液混合，振荡，此时在显微镜下观察应能看到细小的沉淀，如果没有出现沉淀则证明配制过程中出现了问题。当然还需更进一步通过转化实验证实其转化效率。

3．一定要在强度振荡下缓慢加入HEPES液，否则将形成大块状颗粒。

4．利用BES缓冲溶液系统的磷酸钙转染法BES缓冲液的pH必须精确（6.95～6.98之间），并且第一次过夜培养应置于3 % CO₂培养箱中培养，以后细胞培养液的pH应稍偏碱(pH 7.6)。CO2的浓度很关键。在培养细胞之前用Fyrite气体分析仪检测CO₂的百分含量。

5．乙醇沉淀可对需要转染的DNA进行灭菌。对于瞬时转染，这一步不是必需的。可以用450ul含DNA的水溶液取代，其中尽量少含Tris。因为Tris可能会改变沉淀的pH，从而降低转染效率。