基于分子生物学的检验方法

传统的微生物培养检验方法需要经过富集培养、选择性分离、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴定等过程，操作烦琐复杂、耗时费力，而且无法对人工难以培养的微生物进行检测。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，出现了很多适合于食源性微生物检测和分析的分子生物学方法，如PCR技术、实时荧光定量PCR技术、核酸杂交法、基因芯片技术等。这些方法具有操作简便、快速、灵敏度高和特异性强等特点，通常只需要24-48h就可以获得检测结果。

一、PCR技术

1.1PCR技术原理

PCR技术实际上是在模板DNA、引物和四中脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。

PCR反应分为以下三步。

①变性（denaturation)：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形单链DNA。

②退火（annealing)：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，是引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。

③延伸（extension)：在DNA聚合酶的和四种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg^2＋存在的条件下，5'→3'的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。

以上三步为一个循环，每一个循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2×10⁶-2×10⁷拷贝（图6-1) 。

由于PCR检测的是微生物的核酸序列，所以它不能区分检测到的是有活性还是没有活性的微生物。而作为食物中致病菌的检测，更需要检测的是有活性的细菌，可以通过在PCR检测之前对食物样品进行富集来克服上述缺点。另外，PCR反应是一种灵敏度很高的酶学反应，但是在检测食品中的致病微生物时，食物的成分、培养基和DNA提取液都可能降低它的灵敏度，所以它主要是用来对琼脂平板上的纯细菌培养物或菌落进行鉴定，如单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、致病性大肠埃希氏菌、肉毒梭菌、乳酸菌的检测，水中细菌指标测定。

1.2从食品样品中进行PCR检测的基本步骤

从食品样品中提取微生物遗传物质DNA或RNA这是进行PCR反应的前提。在提取特定微生物类的核酸时，应先对样品进行处理，提取的RNA或DNA也必须进行纯化，尽量去除干扰，满足PCR反应的要求。目前，从食品微生物样品中提取核酸的主要方法有氯化艳密度梯度离心法、酚／氯仿抽提法、乙醇沉淀法、亲和色谱法等，有时也结合使用以上几种方法。

以从食品微生物中提取的DNA或RNA核酸作为模板，进行PCR扩增反应，在操作中应注意优化每一步的操作程序，严格控制好每一步反应的温度和时间，循环反应的总数应适当，通常30次左右即可。PCR反应产物的检测与分析经过PCR反应扩增以后，食品样品中DNA或RNA的量成百万倍增加，因而通过适当的方法即很容易检测出来。通常将PCR扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，经过溴化乙锭染色后，在紫外线灯下即可观察到清晰的电泳区带。

1.3普通PCR法检测食品中的沙门氏菌

检验程序按照图6-2中的检验程序进行。

具体方法包括以下几个步骤。

(1)样品制备、增菌培养和分离按照传统的标准方法进行。

(2)细菌模板DNA的制备

①增菌液模板DNA的制备：对于上述传统方法培养的增菌液，可直接取该增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，8000r/min离心5min，尽量弃尽上清；加入50uL无菌双蒸水或加入50uLDNA提取液混匀后沸水浴5min, 12000r/min离心5min，取上清保存于一20℃备用以待检测。一70℃可长期保存。

②可疑菌落模板DNA的制备：对于（1）方法分离到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，加入50uL DNA提取液，再按照①步骤制备模板DNA以待检测。也可使用等效商业化的DNA提取试剂盒并按其说明提取制备模板DNA.

(3) PCR反应体系普通PCR反应体系参见表6-1。

(4) PCR反应参数95℃预变性5min; 95℃变性30s, 64℃退火30s, 72℃延伸30s, 35个循环；72℃延伸5min, 4℃保存

注：PCR反应参数可根据基因的扩增仪型号的不同进行适当的调整。

注：1．反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。

2．每个反应体系应设置两个平行反应。

(5) PCR扩增产物的电泳检测用电泳缓冲液(1×TAE）制备1.8％-2％琼脂凝胶(55-60℃时加入溴化乙锭至最终浓度为0.5ug/mL，也可在电泳后进行染色），取8-15uL PCR扩增产物，分别和2uL上样缓冲液混合，进行点样。用DNA分子量标记物做参照，3-5V/cm恒压电泳，电泳20-40min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。

(6)结果判定和报告在阴性对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带条件下，如待测样品也出现预期大小扩增条带，则可报告该样品检验结果为阳性，可以出具未的检出沙门氏菌的报告；如待测样品未出现预期大小扩增条带，则可报告该样品结果为假定阳性，则回到传统的检测步骤，进一步应按传统的沙门氏菌标准检测方法进行确认，最终结果以传统的方法结果为准。如果阴性对照出现条带和（或）阳性对照未出现预期大小的扩增条带，本次待测样品的结果无效，应重新做实验，并排除污染因素。

1.4其他普通PCR方法

多重PCR是使用两对以上的引物，在同一个PCR反应管内同时检测出同一种或同时检测多种微生物。这种方法保留了常规PCR的敏感性和特异性，减少了操作步骤和试剂，但扩增效率没有单一的PCR高，扩增条件需要摸索协调，引物之间也可能出现干扰。

巢式PCR是先用一对引物对外侧引物扩增含目的基因的大片段，在用一对内侧引物以大片段为模板扩增更小片段，由于使用了两对引物并且进行了两轮扩增反应，试验的敏感性和特异性均增强。在一定情况下，这种方法对减少PCR后扩增产物的污染问题极为有用，但它增加了每次试验的复杂性。

二、实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR (real time fluorogenetic quantitative PCR, FQ-PCR)，是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。

在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念是Ct值。C代表Cycle, t代表threshold, Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为2种：荧光染料和荧光探针。荧光染料法是指SYBR Green I法，荧光探针法包括Taqman探针法、LightCycler法和分子信标（Molecularbeacon）法。

SYBR Green I法是在PCR反应体系中加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。扩增产物序列特异性通过反应后变性分析来确证。在反应的最后阶段，反应体系的温度逐渐升高，双链DNA慢慢地变成单链，从而SYBR Green I染料释放出来，导致荧光强度的慢慢降低，测定整个过程的荧光强度，可以获得PCR产物的变性温度，因为每一种PCR产物都有不同的长度和GC百分比，所以也具有特征性的变性温度。通过变性曲线得到的产物大小可以和PCR产物的电泳结果相比较。这种方法在检测禽肉中的沙门氏菌和干冻食品中的细菌活性方面已有报道。

Taqman探针法是利用Taq DNA聚合酶的5'→3'核酸酶活性来酶切和降解标记报告荧光基团和淬灭荧光基团的探针，所以称为Taqman探针。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，Taq酶的5'→3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。PCR扩增产物的指数增加和荧光强度的增加是相对应的。这个系统现在已经商品化，TagMan系统已经被用来检测食物或者纯培养物中的单核增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌0157: H7和沙门氏菌。

分子信标探针是一种具有茎和环状结构的单链核酸分子，探针分子中环状部分的序列和靶核酸的主要已知序列互补，茎部是通过探针序列任何一侧的2个互补臂序列退火形成。臂序列和靶序列没有关系，一个荧光基团贴附在一个臂的终端，一个非荧光基团贴附在另一个臂的终端。茎部使得这2个基团紧紧地贴在一起。从而使得荧光团释放出来的荧光被FRET淬灭。荧光团一淬灭对的原理是荧光团接收到的荧光转移到淬灭物上，消散为热而不是光，结果荧光团不能释放荧光。但是当探针遇到靶分子时，形成的杂交物比通过臂序列形成的杂交物长并且稳定，因为核酸的二级螺旋结构相对坚硬，探针和靶序列的杂交就排除了同时存在臂序列杂交的可能。这样，探针就经过自然结构的改变而使臂序列分开，进而使荧光团和淬灭物相互分离。因为荧光团和淬灭物不再紧密地连接在一起，所以在紫外线灯照射下能够产生荧光。这种方法对致病性反转录病毒的检测、沙门氏菌和大肠埃希氏菌0157的检测都有应用。

三、核酸杂交法

核酸杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）可以按碱基互补原则退火形成双链。此杂交过程是高度特异性的。杂交的双方分别是待测核酸序列及探针。用于检测的已知核酸片段称之为探针（probe)。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以便于随后的检测。常用的标记物是放射性核素、地高辛半抗原（digaoxigenin)，生物素(biotin)，辣根过氧化物酶(HRP)，还可以标记一些荧光物质如异硫氰酸荧光素（FITC),花青（cyanine, Cy2, Cy3, Cy5）等。

核酸杂交中经常使用的是印迹杂交技术。印迹杂交技术是指将带检测的核酸分子结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。其操作基本流程是：首先用凝胶电泳将待测核酸片段分离，然后用印迹技术将分离的核酸片段转移到特异的固相支持物上，转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变。再用标记的核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交。最后洗去未杂交的游离探针分子，通过放射自显影等检测方法显示标记的探针的位置。由于探针已与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少，则反映出待测核酸分子中是否存在相应的基因序列及其量与大小。

用于核酸杂交的固相支持物的种类很多。常用的主要有硝酸纤维素膜（nitrocellulose) ,尼龙膜（nylon membrane)、化学活化膜（chemical activated paper）等。印迹的方法也有多种：可以直接将核酸样品点样于固相支持物上，称为斑点或狭缝印迹法；利用毛细管虹吸作用有转移缓冲液带动核酸分子转移到固相支持物上；利用电场作用的电转法；利用真空抽滤作用的真空转移法。

在微生物诊断和鉴别方面一个重要的发展就是核酸探针的引进。它可以解决使用抗体检测微生物时存在的非特异性问题。核酸杂交方法的一个主要不利方面，是需要相对大量的样本量（典型的104-105细菌）才能获得明确的结果，因为样品中同时含有大量的非特定微生物会干扰杂交结果，所以，在食品微生物方面主要是利用琼脂平板上的细菌进行菌落原位印迹杂交。

四、基因芯片技术

基因芯片技术是20世纪90年代中期发展起的一门新的生物学技术，首先报道于1995年，是信息技术、微电子技术和生物学技术的结合，其实质是在面积不大的基片表面上有序地点阵排列一系列固定在一定位置的可寻址的识别分子（如寡聚核苷酸或蛋白质等，称为靶标Target)，在相同条件下与待检标记样品基因（探针Probe）进行杂交，然后进行扫读分析获得基因芯片信息，因此该技术具有平行性、高通量等优点，自问世以来广泛应用于生命科学各研究领域，其中用基因芯片技术对微生物的检测和分型是当前的应用研究热点。

基因芯片检测原理仍是基于核酸分子碱基配对，实质上是一种高密度的反向点杂交，杂交类型属固一液相杂交。在固相载体上连接大量靶分子，待测样品分子经过标记后溶于适量的杂交缓冲液中，滴加于固相载体表面，在一定条件下进行杂交。其技术核心是DNA微阵列制备、探针制备、杂交和杂交后芯片信号检测和分析。

(1) DNA微阵列制备通过原位合成法或分配法将靶标固定在可寻址的、已经修饰好的固体支持物上，原位合成法一般只能合成几十个核苷酸，分配法一般是将PCR扩增获得的靶标采用点样法分配在微阵列表面上，片段较长，一般在100bp以上。固体支持物有玻璃、生物膜、塑料等，玻片因其优秀的理化性能而成为最常用的支持物，玻片经过一系列活化处理如氨基化或和醛基化处理后称为基片，靶标通过静电吸附或共价键等方式固定于基片上。制备芯片时要注意靶标浓度，理论上每4nm2 (400平方埃）面积上一个靶标分子最有利于杂交。

(2)探针制备标记是获得基因杂交信号的重要手段，是将指标分子如荧光素等导入待检样品之中，荧光素是目前芯片技术中最常用的指标分子，主要采用酶促介导的反应如体外转录、PCR、反转录等进行标记。如PCR标记是通过DNA聚合酶将荧光标记的引物或荧光分子修饰的核苷酸掺入PCR产物中，在完成对样品荧光标记的同时又实现了对目标片段的特异性扩增。在此过程中，荧光分子通过三种主要途径掺入PCR产物中，第一是在合成PCR引物时，直接以化学方法将荧光分子合成在引物的5’端；第二是在PCR反应中加入荧光修饰的核苷酸类似物如Cy3-dCTP等，由DNA聚合酶将其掺入PCR产物中；第三是对PCR产物通过非模板依赖性的酶促加尾反应在其3’端随机加入荧光修饰的核苷酸。

(3)杂交DNA微阵列原理就是核酸杂交，因此杂交条件是否严谨极为关键。总体上讲，杂交条件选择时必须考虑杂交反应体系中盐浓度、探针G+C％含量和所带电荷、探针与芯片之间连接臂的长度、种类和结构、检测基因的二级结构的影响，同时还与研究目的有关，如突变检测时要鉴别出单个碱基错配就需要更高的杂交严谨性，疾病诊断时的杂交条件
严谨性要求不高，但其杂交温度范围选择更加重要，过于严谨的杂交条件将降低检出率。

(4)芯片信号检测和分析芯片信号检测主要采用激光共聚焦显微扫描仪或CCD成像设备对芯片进行扫描。根据探针标记所用的荧光素种类选择激发光波长进行扫描，如荧光素Cy3和Cy5的激发光波长分别为540nm和650nm，然后应用数据分析软件自动获取基因芯片上的各种信息，并对信息进行处理获得试验结果。

基因芯片技术可以利用相关微生物的特异性基因（如毒力基因、抗生素耐受基因）和基因库中的rDNA序列设计玻片上的片断，这种方法可以快速、准确地检测和鉴定食物中的病原菌，从而保证食物安全。但是，基因芯片技术像其他的新兴技术一样，也有一定的缺点。例如背景干扰比较大、染料与DNA标记时效果不同、从不同细菌中分离出来的RNA的完整性不同、实验费用高和结果分析方法的不一致等。但是作为分子生物学领域的一个崭新技术，它在食源性致病菌的检测和鉴定方面必定会带来新的革命。它可以在一种食品中同时鉴定大量的不同病原菌，并且检测他们的毒力基因和抗生素耐受基因等。基因芯片技术必将在食品加工领域、实验室和食物安全监测方面起到越来越大的作用。

五、环介导等温扩增

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplifieation, LAMP）是2000年由日本研究人员Notomi等发明的一种新型的体外等温扩增特异核酸片段的技术。该技术利用两对特殊引物和有链置换活性的Bst (bacillus stearothermophilus) DNA聚合酶，使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，在等温条件下使引物顺利与模板结合并进行链置换扩增反应。一般情况下，LAMP可以在60min内扩增出109-1010倍靶序列拷贝，得到浓度高达500ug/mL的DNA，其扩增产物既可通过常规的荧光定量和电泳检测，也可以通过简易的目测比色和焦磷酸镁浊度检测。若在反应体系中加入反转录酶，LAMP还可以实现对RNA模板的扩增（即RT-LAMP).

5.1扩增原理

LAMP的技术核心是针对靶基因6个区域的4条特殊引物的设计和具有链置换活性的BstDNA聚合酶的应用。LAMP反应中的4条引物及其对应的6个区域的结构如图6-3所示。F2区和B2c区为位于靶序列两端的特异序列，F1区和Blc区分别为位于F2区和B2c区内侧的特异序列，F3区和B3c区为分别位于F2和B2c外侧的特异序列。4条引物可分成一对内部引物和一对外部引物，内部引物包括上游内部引物（forward inner primer, FIP)和下游内部引物（backward inner primer, BIP)。 FIP包含Flc序列和与F2c互补的F2序列，这两个序列直接相连，即5'-Flc-F2-3'; BIP包含Blc (B1区域互补序列）和B2序列，两段序列直接相连，即5'-Blc-B2-3'。外部引物为分别与F3c和B3c互补的F3和B3序列。

LAMP扩增过程可分为3个阶段：循环模板合成阶段、循环扩增阶段和伸长再循环阶段。在循环模板合成阶段，FIP的F2序列先结合到模板DNA的F2c上引导合成互补的DNA链。进而外引物F3结合到模板DNA的F3c上，引导合成模板DNA的互补链，释放出由FIP引导合成的互补链。被释放出的互补链5'端的Flc和Fl发生自我碱基配对形成一个环状结构，同时引物BIP结合到其3'端，引导合成该链的互补链，并把5’端的环状结构打开，以类似于F3的方式，外引物B3从BIP引物外侧结合到B3c上引导合成该链的互补链，同时置换出由BIP引导合成的互补链。被置换出的互补链两端分别带有Blc-B2-B1和F1-F2c-Flc互补结构，自然发生碱基配对，形成一条哑铃状单链结构。该结构是LAMP法基因扩增循环的起始结构，再经过后续的循环扩增反应最终形成一系列大小不一的由反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜结构的DNA片段混合物。

5.2 LAMP特点

LAMP是一种全新的恒温核酸扩增方法，和传统的核酸扩增方法相比，其反应原理和引物设计更为复杂，但是具有传统方法无法比拟的优点。

(1)等温扩增只需要一个恒定温度就能完成扩增反应，不需要PCR那样循环地改变温度。

(2）快速高效整个扩增反应可在30-60min内完成，扩增出109-1010倍靶序列拷贝，DNA产量高达500ug/mL.

(3)特异性高由于4个引物靶向目标核酸片段的6个区域决定了LAMP的高特异性，即使在有非靶DNA共存的条件下，LAMP扩增的特异性也不受影响。

(4）灵敏度高LAMP能检测到PCR检测限1/10的拷贝数，扩增模板可以只有10拷贝甚至更少。

(5)产物检测方便LAMP反应产生大量的产物，可利用直观的焦磷酸镁浊度检测法或荧光目测比色法对扩增结果进行简便快速地检测。

(6)设备简单LAMP等温扩增和产物直观检测的特点决定了其不需要复杂的设备，它只需一个简单的恒温器，不需要昂贵的检测设备，对现场检测或基层应用相当有利。目前已经有使用LAMP法检测肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC)、肠侵袭性大肠埃希氏菌(EIEC)、产肠毒性大肠埃希氏菌（ETEC)、沙门氏菌、副溶血性弧菌的报道。