一、细菌污染

（一）支原体污染

1.概述

人和动物均有支原体的寄生，如人的口腔寄生有各种支原体。在哺乳动物细胞培养物里面，发现的支原体污染往往来源于操作者和所使用的动物血清。操作者的毛发、口腔、穿着的衣物、实验动物的皮毛及日常无菌操作的环境都可能是支原体污染的来源。购买血清商品前，需要明确制造商已经进行了检验或采取了滤过去除措施或其他措施，确保血清无支原体污染，慎重的做法是自行进行必要的实验室检验。

虽然我们在培养用液的无菌滤过时，采用的滤膜孔径是0.22μm。支原体是一类无细胞壁的原核微生物，细胞大小在0.2-2μm之间，细胞容易变形通过细菌滤器。
哺乳动物细胞培养物不容易发现是否已经受支原体污染，尤其对缺乏操作经验的初学者而言，更是不容易发现。

被支原体污染的培养物，培养液不发生浑浊，多数细胞无明显形态变化，镜检时需要仔细观察才会注意到。严重感染支原体的细胞培养物，细胞增殖减缓，部分贴壁细胞变圆不贴壁生长。支原体消耗培养液中的精氨酸，抑制所培养细胞DNA、RNA的合成，降低细胞的抵抗能力。

各类细胞对支原体的感受性和反应性均不同，原代细胞和二倍体细胞一般不受支原体污染，多倍体细胞和无限细胞系对支原体敏感。

2．支原体污染检测

目前建立了比较成熟的检测方法，有的有商品检测试剂盒。

常用的检测方法有支原体PCR检测试剂盒检测，荧光指示细胞法检测，培养法检测和扫描电镜法检测等。

3．污染的预防

在培养基中添加对支原体有抑制杀伤作用的特定抗生素。需要谨慎使用细胞培养用血清，使用前进行支原体检测。

（二）快生长细菌污染

1．概述

细菌可以泛指原核细胞生物，一般是原核单细胞生物，通常有细胞壁，包括细菌、放线菌、螺旋体、衣原体、支原体和立克次氏体等。

在细胞培养中，人们提及细菌污染时，一般指细菌和放线菌，一般都有细胞壁，并且都含或多或少的肽聚糖成分。

2．污染的来源

主要来源有4个方面：①操作者的指甲缝、皮肤、毛发、口腔、穿着的衣物。②日常无菌操作的环境、实验动物的皮毛，以及操作时所用无菌器材的无菌程度。③培养用液的滤过除菌程度或灭菌程度。④无菌操作技术。

3．污染的判断

快生长细菌指那些20.30min分裂1次的那些细菌。

这种污染比较常见。一般在培养过夜后即观察到培养液浑浊，或培养液pH明显变酸发黄（酚红指示剂），或在培养液上层形成菌膜，肉眼观察即可见这些现象。镜检时能观察到大量细菌，如需判断是否是球菌或杆菌时，可在400×视场下观察。

4．污染的预防

快生长细菌的污染预防，主要采用两种措施。措施之一是严格控制污染源，谨慎进行无菌操作。另一措施是合理使用抗生素，如在培养液中新鲜添加100U/ml的硫酸庆大霉素，或同时添加100U/ml的青霉素和链霉素（俗称双抗生素）。

发生污染的培养物，是很难用离心或使用高浓度抗生素等方法去除快生长细菌的。

一旦发现培养物污染有快生长细菌，应及时用lmol/LHCl或lmol/LNaOH溶液杀灭，终止培养物生长，或直接废弃培养物。如果在多孔细胞培养板中发现个别培养孔存在快生长细菌污染，建议小心去除该孔的培养液，并添加lmol/LHCl或lmol/LNaOH溶液，以免污染扩散到周边的培养孔。

（三）慢生长细菌污染

慢生长细菌的污染来源类似快生长细菌，尤其是操作者体表寄生菌。一般在培养过夜后不容易观察到培养液浑浊，即使镜检也不容易观察到大量细菌。通常在培养24-48h后才出现培养液浑浊的现象，培养液pH才明显变酸发黄（酚红指示剂），不及时镜检时容易忽略。慢生长细菌的污染预防措施类似上述快生长细菌的情形。发现及时，也许可以使用5-10X高浓度抗生素进行选择性杀灭。

二、真菌污染

污染来源类似快生长细菌，尤其是操作者体表寄生菌。

酵母污染比较难及时发现，一般在污染发生的24-48h后容易观察到培养液颜色的变化，变成黄色，培养液发生浑浊。低倍镜检时可见酵母菌落，高倍镜检则可分辨出酵母细胞形态。

少量感染霉菌后，培养过夜的培养物在仔细镜检时可发现霉菌抱子萌发的菌丝。培养24-48h后，则非常容易发现，肉眼可见培养液颜色变黄，可见液面上出现的点状白色或浅黄色菌落。镜检时可见纵横交错的菌丝。

关于真菌感染培养物的处置，在发现初期，如仅有少量霉菌菌丝阶段，可以考虑使用5-10×高浓度抗生素进行选择性杀灭。一般建议废弃该培养物，并及时用lmol/LHCl或lmol/LNaOH溶液杀灭。如果在多孔细胞培养板中发现个别孔存在真菌污染，尤其少量霉菌阶段，建议小心去除该孔的培养液，并添加lmol/LHCl或lmol/LNaOH溶液，以免污染扩散到周边的培养孔（图9-8)。

预防真菌感染培养物的措施之一是严格控制污染源，谨慎进行无菌操作。另一措施是合理使用抗生素，添加一定浓度的抗生素到培养液中。

三、病毒污染

细胞培养物中有内源性病毒污染和外源性病毒污染。内源性病毒指细胞株或细胞系自身带有的特定病毒，如B95-8细胞会释放出高滴度的EBV病毒。MJ细胞释放T细胞白血病病毒。外源性病毒指培养环境、无菌操作环境、操作者等原因播撒的病毒。有些病毒甚至影响操作者的健康状况，有些会影响培养细胞的生活状况。明确有病毒污染的培养物的操作，建议使用生物安全柜，以保证操作者的安全。

四、非微生物污染

（一）细胞交叉污染

细胞交叉污染指细胞培养操作过程中，多种细胞培养物同时培养时，如过混杂使用培养用液或无菌器材等原因容易造成同一培养物中含有两种以上细胞的情形。注意采取适当的防止细胞交叉污染的措施。如标记出专用的细胞培养用液，长丝滴管和移液管使用后及时更换。

（二）化学污染

化学污染容易导致培养细胞坏死或凋亡。化学污染物质包括残留洗涤剂、残留细胞碎片、重金属离子。避免化学污染的主要措施之一是，确保使用的无菌器材如试剂瓶、离心管、长丝滴管、移液管、吸嘴等清洁，尤其反复清洗灭菌使用的器材。另外，要避免化学污染，还需注意务必谨慎进行无菌操作。诸如：①取用培养用液的无菌器材的吸液端，一旦接触皮肤、超净工作台台面等非无菌表面后，应及时弃用，更换新的器材。②放置内表面朝下盖子的超净工作台台面应预先除尘灭菌。③包装细胞培养用液的试剂瓶开盖后应注意勿使其他器材在上方通过，尤其操作者的双手不能在上方通过。④无菌操作时，垂直风淋超净工作台的边窗开启的高度不宜过高，不能关闭风淋，以免外环境的粉尘进入操作环境。