(1)哺乳动物培养细胞（CHL)SCE测试法

1)仪器设备：细胞培养首先需要有良好的无菌操作间。室内密封性良好，经消毒杀菌后可长时间维持洁净无菌。如无过滤灭菌空气送入式无菌间，用一般无菌室并配有超净工作台也可完成工作。

①恒温培养箱：使用CO2孵育箱比较理想，保持5%CO2浓度可维持培养液稳定的pH
值；如条件不允许，用普通隔水式恒温箱也可满足要求，温度维持在37℃±0.5℃，将培养
瓶塞塞紧，可维持细胞培养所需的pH值。

②电热干燥箱：用于烘干玻璃器皿和干热消毒。干热消毒温度要求达160℃,2h以上。

③超净工作台：最好选择双侧可操作式、空间较大型的，便于双人对坐操作。

④冰箱：普通冰箱，供经常使用的试剂、药品、培养液等冷藏用；-20℃低温冰箱，供批量贮存血清、试剂、培养液等用。

⑤天平：普通天平、分析天平、电子分析天平等，供称量药物、试剂等用。

⑥显微镜：普通光学显微镜、倒置显微镜、照相显微镜等。前两者必备。

⑦离心机：普通离心机，用于细胞悬液离心，最大转速4000r/min即可；小型台式离心机，供细胞复苏时离心用；高速离心机，制备S9用。

⑧高压消毒锅：小型手提式加热式。供各种不适于干热消毒的制品消毒用，如橡胶制品、塑料制品、针头和试剂等。

⑨水纯化装置：可根据各实验室使用水量大小而选购不同型号的纯化水装置。实验用水多用双蒸以上的蒸馏水。

⑩抽滤装置：用于不能加热消毒的培养液、试剂和小牛血清等除菌时用。玻璃细菌滤器，一般用G6漏斗抽滤。此滤器清洗、消毒、灭菌等操作较麻烦。目前使用金属滤器较多，可选用不同孔径滤膜加压过滤。滤器的清洗消毒较方便。滤膜为一次性用品。

⑪酸度计：用于测定各种溶液的pH值。

⑫电磁加热搅拌器：配制难溶试剂时加温、搅拌用。

⑬超声波洗涤机：洗涤器皿用。

⑭水浴锅：用于小牛血清灭活和染片等。

⑮紫外灯或黑光灯：30W紫外灯，或两个20W黑光灯，供SCE染片时用。

⑯CO2钢瓶：供应CO2孵育箱用。

⑰加样器：5、2、1、0.5、0.2、0.1m1等，用于加受试物、消化液、青霉素、链霉素等用。

2）器材：细胞培养需用大量器材，品种与数量都要充分。按正在使用、正在清洗、已清洗好备消毒、已消毒好备用等进行分类管理。玻璃制品的质量要求严格。除厚薄均匀、透明度好外，还要求是中性玻璃，尤其培养瓶质量要求很高，否则细胞不贴壁生长。

①试剂瓶：500、250、100、50、l0ml等各若干个。输液瓶亦可用于贮存试剂，因其有刻度，瓶塞紧，很好用。

②培养瓶：一般常用25m1玻璃制品，也可用培养皿和培养板。

③容量瓶：1000、500、250、100、50m1等，供配试剂用。

④量筒：500、250、100、50、20ml等，配试剂用。

⑤烧杯：500、250、100、50ml等。

⑥离心管：l0ml刻度离心管，需用量较多。

⑦三角瓶：250、100、50m1等，配营养液用。

⑧吸管：10、5、2、lml等，移液用，需用量多。

⑨滴管：无刻度，移液和吹打混悬液体用，需用量多。

⑩金属盒（饭盒）：分装培养瓶、小试剂瓶、针头、滴管、胶塞等物品消毒、染色时用。

⑪其他抽滤装置，G5、G6砂芯漏斗，注射器，冻存管，酒精灯，吸头，橡皮吸球，试管架，橡皮塞，凉片架，凉片板，血球计数板，滤膜，滤纸，pH试纸，记号笔，平皿，工作服，口罩，帽子，拖鞋等。

3)试剂配制：

①培养液：目前对化学物质和环境污染物遗传毒性监测，最常用的细胞株有CHL、CHO、V79等，此类细胞用Eagle、MEM、RPMI-1640和F-12等培养基均可得满意结果，可按各培养基说明书配制。现介绍用RPMI-1640(Sigma公司出品）配制方法。RPMI-1640(Sigma公司出品）纸袋封装，每袋10.4g，加Hepes3g，加NaHCO32g，溶于l000ml二次蒸馏水中，或按比例缩减，无菌过滤，分装于2-3个试剂瓶中，密封，置-20℃冰箱保存，可用半年。用时取出存4℃冰箱，可用2周。
全培养液配制比例：RPMI-16409份，小牛血清1份，青霉素100单位/ml培养液，链霉素l00μg/ml培养液，调pH值7.0-7.2即可。人淋巴细胞培养时，需加入肝素、植物凝集素（PHA)。

②消化液：

a.0.25%胰蛋白酶：称取活性为1：250的胰蛋白酶粉剂0.25g，另准备D-Hanks工作液l00ml。先用半量D-Hanks工作液于烧杯，在控温磁力搅拌器上搅拌约1-2h使溶解，温度不超过36℃。再将剩余的D-Hanks工作液全部加入，用NaHCO3调pH值至7.2，然后，除菌过滤，分装于青霉素小瓶中，密封，置-20℃冰箱保存。

b.0.5％胰酶-0.02%EDTA平衡盐溶液：称lg活性为1：250胰酶，溶于200ml无菌的0.02%EDTA平衡盐溶液，在室温下溶解4h或4℃过夜，用5%NaHCO3调pH值至7.2,分装于青霉素小瓶，-20℃冻存。

③D-Hanks液：D-Hanks原液，分别称取NaCl80.0g,Na₂HPO₄•2H₂O0.6g,KH₂PO₄
0.6g,NaHCO₃3.5g，加二次蒸馏水溶解至l000ml。配制时要注意按顺序逐一加入上述试剂，应等前一种试剂完全溶解后再加下一种试剂。原液配好后分装于500m1或250ml试剂瓶中，8pd/in2*15min高压灭菌，冷后置普通冰箱保存。用时取D-Hanks原液l00ml，加三次蒸馏水896ml，再加0.5％的酚红液4m1,混匀即成，存4℃冰箱。

④0.02%EDTA平衡盐溶液：称EDTA0.2g,NaCl8.0g,KC10.2g,Na₂HPO₄•12H₂O₂.89g,KH₂PO₄0.2g,葡萄糖0.2g溶于l000ml二次蒸馏水中，高压灭菌，用NaHCO₃调pH值为7.2。

⑤0.5%酚红溶液：称0.5g酚红粉，置干燥研钵中研磨均匀，边磨边加入0.lmol/LNaOH
12ml，使之完全溶解，然后加二次蒸馏水至100ml,4℃冰箱保存。

⑥细胞冻存液：在含20%-30％小牛血清的1640培养液中，加入二甲亚砜，使其终浓度为10%（或加入丙三醇并使终浓度为5%)。

⑦抗菌素：

a．青霉素：取80万单位青霉素一瓶，注入8m1生理盐水，分装于灭菌小塑料带盖离心管中，-20℃冰箱保存。

b．链霉素：取100万单位链霉素一瓶，注入l0ml生理盐水，分装于灭菌小塑料带盖离心管中，-20℃冰箱保存。

⑧小牛血清或胎牛血清：是细胞培养时必不可少的营养物和刺激因子，采购时需选择新鲜出品，外观清澈、微黄，用前须置56℃水浴，30min灭活。无菌过滤（血清质量很好时，可免除），然后分装于青霉素小瓶（避免反复冻融，影响血清质量）密封，置-20℃冰箱保存。

⑨S-9混合液：S-91m1,NADP（氧化型辅酶II）33.8mg,G-6-P-Na(6磷酸葡萄糖）14.1mg,1.65mol/LKCl和0.4mol/LMgCl2混合液0.2m1,0.2mol/L磷酸缓冲液5m1,无菌二次蒸馏水3.8m1,混合得l0mlS-9混合液。现用现配，其加量不得超过培养液的10%。

⑩碳酸氢钠溶液：用于调pH值，可配10%,5%溶液，用二次蒸馏水溶解，高压灭菌，8pdl/in215min，密封存于4℃冰箱，用过后再用时必须重新灭菌，或买市售安瓶装品。

⑪秋水仙碱：一种抑制纺锤体的生物碱，起到积累更多染色体中期分裂相的作用，通常培养液中含0.2μg/ml即可达很好效果。秋水仙碱毒性强烈，可长期保存。称l0mg秋水仙碱溶于100m1灭菌生理盐水，得0.01％浓缩液。4℃冰箱避光保存（最好用黑纸包好瓶子）。用时再按1：10稀释。

⑫低渗液：低渗处理为使细胞膨账，核膜破裂，染色体适度分散而易观察。一般用0.075molKCl溶液。称5.598KC1,溶于1000m1蒸馏水中。室温保存。

⑬细胞固定液：起固定细胞表面，防止细胞粘连成团作用。常用甲醇和冰乙酸混合液，
按3：1比例配制。需现用现配，配好的液体不应超过1h，因为混合液易挥发，影响固定效果。

⑭5-溴脱氧尿苷(BrdU)溶液：用无菌青霉素小瓶称BrdU4mg，加入无菌生理盐水4m1，用黑纸包瓶（避光），置4℃冰箱保存。

⑮2×SSC液：称17.538NaCl,8.828柠檬酸钠（Na3C6H7•2HO2)，溶于1000ml蒸馏水中。

⑯Hoechst-33258液。

⑰磷酸缓冲液（PBS):

a．称取9.478Na₂HPO₄溶于1000m1蒸馏水。

b．称9.088KH₂PO₄溶于1000m1蒸馏水。根据不同的pH值需要，用时a、b液按不同比例配制。

⑱Giemsa染液：取Giemsa染料lg，放研钵中，加甘油少许研磨，边研边加甘油，共加66ml，置60℃温箱中保温90min，冷却后加66m]甲醇（也可按比例一次多配，供长期使用），混匀后于室温静置1-2周，过滤，用棕色瓶贮存备用。临用时磷酸缓冲液稀释至所需浓度。

4)染毒：环境水样或化学污染物进行SCE监测试验之前，须经过样品处理，使成为固体样品。然后，需确定是否为水溶性的。如是水溶性的物质，可用灭菌生理盐水溶解；如是非水溶性物质，可用灭菌二甲亚讽(DMSO)溶解。受试物在培养基中的浓度最高不得超过5mg/ml。受试物浓度一般以能抑制50％的细胞生长浓度为最高浓度；或以抑制细胞有丝分裂指数减低50％为指标，因抑制有丝分裂也是物质毒性的一种表现。然后以倍比稀释法或数量级递减稀释。确定受试物最高浓度，应多设几个剂量组，作细胞存活曲线，求出细胞存活一半时受试物的浓度，以免需多次实验确定。
确定染毒剂量方法：

a．以细胞生长克隆数作细胞存活曲线求IC50。先用培养基稀释细胞悬液为1000个/ml左右，每培养瓶加0.5m1细胞悬液，再加2.4ml培养基，混匀后置37℃恒温箱培养，至细胞贴壁后染毒。将稀释好的受试物每瓶加0.1m1，应设7-10个浓度组，覆盖三个数量级，每个浓度组设三个平行样，染毒24h，去掉培养液，再换新鲜培养液3ml，继续培养4-7d,使形成克隆。去掉培养液，加甲醇0.5ml固定10-15min,Giemsa染色，数克隆数。以空白对照克隆数为100%，各剂量组克隆数除以空白组克隆数，得各剂量组克隆百分数。纵坐标为各剂量组克隆百分数，横坐标为受试物浓度，绘制细胞存活曲线，求出IC50的浓度。

b．活细胞计数法求IC50。准备好接种细胞数一致、每瓶含培养液2.9ml、已培养到细胞指数生长期的培养瓶若干瓶，加入已溶解好的不同浓度的受试物0.lml,混匀后置37℃恒温箱培养。每种浓度需三个平行样，并设空白对照。继续培养24h。倾去全部培养液，消化瓶壁细胞，加入定量培养液稀释并混匀为细胞悬液。取部分细胞悬液，一按9:1比例加入0.4％台酚蓝染液。静置2-3min，取细胞悬液滴在血球计数板盖玻片边缘，使液体充满计数板，但不能有气泡或过多液体使盖片漂浮。如操作不成功，可以重做。然后在显微镜下计四个角大方格中的活细胞数。活细胞不着色。如有压线细胞，计右侧和上线的，不计左侧和下线的。每个样品应重复计数一次，取平均值。细胞计数公式：

细胞数／ml=4大格细胞总数/4×104×稀释倍数

分别求出每种浓度活存细胞数后，在半对数坐标纸上作图。以活存细胞数作纵坐标，受试物浓度作横坐标，绘出细胞存活曲线，求出受试物半数抑制浓度。以IC50为最高剂量组，中剂量组可以倍数关系递减，使结果呈一定剂量关系为原则。

5）实验步骤：染毒剂量确定后，可进行正式实验。先设计分组，要设对照组（空白对照、溶剂对照、阳性对照等），实验组数根据实验目的设置。每组至少设两个平行样。将繁殖有足够数量、处于指数分裂期、贴壁生长良好的的CHL细胞，消化后用全培养液制成均匀一致的细胞悬液，每瓶加入量根据稀释细胞数而定，每瓶约5×105个/ml或1×106个/ml等量的细胞悬液，然后加入全培养基使总量为3.0m1。置37℃恒温箱培养，约24-48h,观察细胞贴壁呈指数生长期。换不含血清的培养液每瓶2.9ml，加入配制好的不同浓度的受检物、阴性、阳性对照物，使25ml培养瓶中培养液总量为3.0ml,混匀，置恒温箱培养染毒1-2h；加活化剂S9时，换不含血清的培养液每瓶2.6ml，加入配制好的不同浓度的受试物、阴性、阳性对照物各.lml，加配置好的S9活化剂0.3ml，使25ml培养瓶中培养液总量为3.0m1,混匀，置恒温箱培养染毒1-2h。去除含受试物的培养液，用Hanks液洗一遍细胞后，加入含BrdU(10μg/ml培养液）的完全培养液避光培养。如用普通温箱，则将瓶塞塞紧，如用CO2孵育箱则瓶盖要松，以使CO2能调节培养液的pH值。继续培养两个细胞周期（24-28h,CHL细胞周期为12-14h)。在终止培养前2h，按0.02μg/ml（培养液）加入秋水仙碱，终止培养时倒掉培养液，消化收获细胞，制片。

染色体片制备：

将培养到期的培养基全部倒入事先已编号的离心管中，向每瓶细胞中加入消化液0.5m1，放置2--3min（视室温而定时间长短），使细胞全部脱落。再用原培养液将细胞转入离心管，并轻轻将细胞打成混悬液。以1000r/min离心5min，弃去培养液。每管加0.075mol/LKCl低渗液5m1，置37℃温箱15min。缓慢加入lml新配置好的固定液（甲醇二冰乙酸＝3：1)，轻轻混匀。以1000r/min离心5min。弃去上清液，加固定液4m1混匀，固定20min。以1000r/min离心5min，至少固定二次，弃去上清液。加0.1-0.2m1新固定液，充分混匀制成清澈的细胞悬液。滴2-4滴于清洁、冰冻的玻片上，置凉片板上空气干燥。每一样品需制2-3片。

6）分化染色：在细胞的DNA合成过程中，BrdU能作为核普酸前体物替代胸腺嘧啶核苷MR)掺入到新合成的核苷酸链中。所以，当细胞在含有BrdU的培养液中经历第一次分裂时，形成的中期染色体中两条姐妹染色单体的DNA双链的化学组成就产生了差别。其中一条DNA链中的TdR的位置被BrdU代替，而另一条DNA链中的TdR未被代替。此时，当用Giemsa染色时，两条染色体着色程度一致都被深染。而当细胞经历了两个细胞周期之后，中期染色体的DNA双链在化学组成上有了进一步的差别，其中一条染色单体的双链中都含有BrdU；而另一条单体中，仅有一条链含有BrdU。双股DNA链都含有BrdU的染色单体，当用热盐溶液处理或受到光的照射后易被水解，降低了与荧光染料或Giemsa染料的亲和力，从而着色浅，造成了两条染色单体染色深浅的不同。SCE分化染色法可采用以下几种：

a.Hoechst33258黑光灯法：将老化3-7d的染色体标本依次浸入0.14mol/LNaCl,0.004mol/LKCl和0.01mol/L磷酸缓冲液（pH7.0)中各5min。浸入用0.0lmol/L磷酸缓冲液配制成的lgg/mlHoechst33258荧光染料中20min。用磷酸缓冲液洗两次，每次5min。

取一金属盒放在50℃的水浴箱支架上，将染色体标本平放在一金属盒的小玻璃架上，细胞面向上，盒盖中放入2×SSC溶液，使液体刚覆盖标本，同时用二只并列的黑光灯照射标本40min，灯管距标本3-5cm。在照射期间随时加2×SSC液，保证照射期间标本不干。照后将标本浸入二次蒸馏水洗两次，每次5min。用2.5%Giemsa染色5-l0min（染色时间与气温有关，室温高，染色时间短，反之，时间长）。然后在自来水流下冲洗，空气中干燥，镜下看染色效果。

b．热磷酸二氢钠加Giemsa染色法：将制备好的染色体标本老化3-7d后，放入70-8℃烤箱中烤1-2h，将标本浸入83-88℃lmol/LNaH2PO4(pH8.0)溶液中处理15-20min，用温蒸馏水冲洗三次，再用普通蒸馏水冲洗标本至干净，用2%Giemsa染色20min,自来水冲去染料，空气中干燥，备镜检。

c．紫外灯照射Giemsa染色法：在恒温水浴箱内放一金属盒，内含2×SSC溶液，调水箱温度，使2×SSC溶液达50，然后，在金属盒内放一铁丝架或玻璃架，其高度以2×SSC溶液不超过架子为宜。将染色体标本平放在架子上，并向表面滴加2×SSC溶液，然后盖上一张擦镜纸，使纸的两端浸在2×SSC溶液中，在水浴箱上面放一带罩的紫外灯，与标本垂直，距离为6cm，照射15-20min（紫外灯外面需用黑纸或黑塑料布覆盖，操作者需带墨镜），用蒸馏水冲去擦镜纸及玻片上的2×SSC液，用稀释为2％的Giemsa(pH=6.8)染液染色10-20min，自来水冲洗，蒸馏水冲洗，空气中干燥，备镜检。

7）镜检记录：选择细胞轮廓完整、染色体铺展良好、区分染色好、含有二倍体的细胞观察计数。体外实验，每实验点观察记录25-50个中期分裂相的SCE；体内实验，平均每只动物观察记录20^50个中期分裂相的SCE。记录的标准是：凡在染色单体端部出现交换计为一个SCE，在染色单体中间出现的交换计为两个SCE。凡在着丝点部位出现交换计为一次交换，但必须区分不是两条染色单体在着丝点部位发生扭转。大多数SCE的记录困难不大，但在以下情况有时难以分辨：

①分化染色反差过强或过弱带来的变异。

②邻近着丝点扭转180度。

③有的染色体一条染色单体上带有暗的端区，但另一条染色单体上不带可分辨的浅色区。

④多重而间隔很近的SCE的观察计数较困难。在观察分析时注意区分，积累经验则能克服。

(2)人外周血淋巴细胞SCE测试法

人淋巴细胞SCE测试法所用仪器、器材和试剂，与哺乳动物培养细胞（CHL)SCE测试法基本相同，无须再另作更多实验筹备工作。人淋巴细胞可在血站购买，也可选健康年轻的提供者，用时现抽静脉血。试剂需另配制：

①肝素：起抗凝作用。取注射用肝素一支，用无菌的生理盐水配成500μg/ml溶液。

②PHA：人淋巴细胞在外周血中是G0期，PHA可刺激细胞进入细胞周期。PHA可购市销安瓶装的，用无菌生理盐水配制成10mg/ml，现用现配。也可用菜豆自制，无菌过滤，冰冻保存。

实验步骤：由静脉采血5ml，放入含有0.2ml肝素的瓶内，混匀待用。在无菌间配制培养液，其比例关系如下：RPM116409ml，小牛血清lml,PHA0.05m1，青链霉素（(100U/ml,100μg/ml),BrdU（按最终浓度为l0μg/ml)，调pH值为7.2.BrdU也可在培养24h后再加入（加入BrdU后需避光培养）。将配制好的培养液分装在消毒过的培养小瓶中（可用容量为10-15ml的青霉素小瓶），每瓶1.7-2ml（可按瓶容量而定），每瓶加静脉血0.1-0.2ml（可按瓶容量而定，但每瓶血量应一致），于37℃恒温箱培养72h。细胞收获前4h加秋水仙素，细胞收获、制片、分化染色与CHL培养细胞相同。染毒：可在培养开始时加入，也可在培养24-30h时加入受试物（即第一个S期）；需活化的化学污染物，淋巴细胞本身有一定水平的微粒体活化及灭活功能，但如需要也可用S9混合液联合使用。通常是培养48h，离心弃培养液，加入无血清含S9及受试物的培养液，让细胞悬浮培养1h后，用磷酸缓冲液洗两次，再用含血清的新鲜培养液继续培养，其他步骤同前。

(3）小鼠整体SCE测试法

整体动物实验无需细胞培养实验条件，无需进行活化实验，但需动物饲养条件。整体实验需用的BrdU量大，一方面由于掺入的细胞量多，另一方面BrdU在体内很快被肝脏分解，如果是水溶性的，需多次注射，很不方便。因而，后改制成缓释剂，包埋在小鼠的皮下，每只需用8-10mgBrdU。选18-22g体重的小鼠，每组3-5只，动物染毒与一般动物实验类同。将BrdU缓释片包埋在小鼠皮下，24-30h后，处死动物，剥离股骨，用酒精纱布揩去肌肉，剪去股骨头，用1号针头在股骨另一端扎一孔，用注射器吸取0.5ml2%柠檬酸钠，将股骨内的骨髓冲洗出来，可反复冲洗2-3次，然后离心去柠檬酸钠液，再低渗、固定、制片，分化染色等均同前。