本部分介绍检测贴壁细胞蛋白质半衰期的标准方法。虽然最初的代谢标记程序稍有不同，但同样的原则可以用于非贴壁细胞蛋白质半衰期的检测。

（1) 细胞培养准备

1) 为了检测通过瞬时转染所表达外源蛋白质的半衰期，将2×106HeLa细胞接种至1个或2个l00mm培养皿中，CO2培养箱培养过夜。

2）用脂质体将表达目的蛋白的质粒转染至细胞中，培养12-16h。

3) 用PBS洗细胞3次，换成含有10％胎牛血清的新鲜DMEM培养基，培养6-8h。

4）弃掉培养基，胰酶消化，将细胞悬液平分到5个100mm的培养皿中，在37℃、CO2孵育箱中，培养过夜。

为检测外源蛋白质的半衰期，把细胞平均接种到5个100mm的培养皿中，培养一天。第二天细胞密度最好达到60％-80%，此密度为最佳的脉冲标记密度。

(2）脉冲示踪

1) 吸弃培养基，用5 ml预热的PBS，将细胞洗3次。

2) 彻底移弃PBS。用1ml含透析胎牛血清且不含蛋氨酸和半胱氨酸的DMEM收集细胞。在37℃培养lh。偶尔摇一下培养皿，使细胞被培养液完全覆盖。

3）每个l00mm培养皿中加入100μl标记35S-蛋白的Ci混合物。37℃孵育30min，每3-5min摇一下培养皿。

4）弃去放射性培养基。用5 ml预热的PBS洗细胞。

5) 对处理时间为0组，继续裂解细胞准备提取。

6）对于其他处理时间组，每个皿中，加3ml预热的追加培养基（培养基中含有10％胎牛血清、3mmol/L L-蛋氨酸、1 mmol/L L-半胱氨酸），立刻放入CO2孵育箱中。注意将能穿透细胞膜的蛋白酶抑制剂在平行实验组中加到追加培养基中，以推测目的蛋白降解是否与特殊蛋白水解机制有关。

7）在预定时间点弃掉培养基（0.5, 1.0, 2.5, 5h)。用3ml PBS洗一次细胞，然后将PBS完全弃掉。

8) 加入300 μ1含有蛋白酶抑制剂的预冷RIPA裂解液。用细胞刮将细胞刮至新微量离心管中。细胞样品可放入液氮中保存。若用免疫沉淀和SDS-PAGE分析背景很高，可以使用变性的裂解缓冲液。

9) 用Vibra-CellTMVC500 Sonicator探头超声细胞3-5个脉冲。

10）将含有细胞样品的微量离心管放在翻转样品旋转仪上，4℃上下颠倒混匀30分钟。

11) 4℃、14000rpm离心l0min。将上清转移到新的离心管中。

12）用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。用Bradford试剂盒中的缓冲液，将样品稀释200-500倍以消除RIPA缓冲液中去污剂的比色反应。可选用Bio-Rad DC蛋白定量试剂盒，其可以兼容离子型和非离子型去污剂。

(3) 免疫沉淀反应、SDS-PAGE、放射自显影术

1) 将500 μg-l mg的细胞裂解液移至新微量离心管中。用RIPA缓冲液使总体积达到300-500μl。

2）在裂解液中加入20μlpre-washed Protein A或protein G。4℃上下颠倒混匀lh。

3) 4℃, 14000rpm离心10秒，将上清移至一新的离心管中。

4）加入适当体积的抗体到每组样品中。在4℃上下颠倒混匀1 h。

5）暂短离心。加入50μl50% pre-washed Protein A或protein G。4℃翻转摇动过夜。

6) 4℃，最大转速离心10秒。

7）移弃上清。加1 ml RIPA缓冲液混匀。4℃、离心10秒，琼脂糖沉淀中包含与其相结合的目标蛋白。吸弃上清。

8)重复上步操作两次。

9）从琼脂糖移弃所有上清。加入50μl 2× Laemmli缓冲液，95℃加热5分钟。

10）暂短离心。用SDS-PAGE洗脱蛋白质。

11) 电泳完毕后，用50％甲醇和10％乙酸固定液固定胶30分钟至lh。真空干胶，然后用磷屏采集信号。

12）用磷光影像分析系统对蛋白条带进行定量，并画出对数曲线。