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免疫组化非特异性染色及解决方法

发布时间:2015-09-17 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1338

非特异性染色常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处,以及坏死组织和固定不良的组织中心处。表现为弥漫性、均匀性的背景染色。也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。可能的原因如下:

IgG与Fc受体结合

多见于冰冻切片,主要是和二抗反应,因为一抗一般稀释度均较大,因此,Fc受体的干扰基本不存在。避免方法:可用与二抗相同种属的正常血清封闭切片;或用不含Fe段的抗体,但价格贵。

静电吸附

抗体是一种带负电荷的球蛋白,容易和带正电荷的组织相结合,如胶原纤维。避免方法:尽量稀释一抗;降低抗体的电荷,如用2.5%NaCl, 0. 05mo1/L TBS代替PBS;用去污剂(如Triton X-100)处理切片。

二抗与组织中的IgG结合

如羊抗兔的二抗可与标本中(人)IgG发生交叉反应,进化上越接近的动物,交叉反应越明显,如人与猴、兔与豚鼠。避免方法:用与待测组织相同的5%的正常血清稀释二抗。

组织中残存醛基与IgG的结合

如醛类固定后未能彻底的冲洗,残留醛基可以和IgG结合。避免方法:彻底冲洗或用0.02%新鲜的硼氧化钾液处理l0min后冲洗。

内源性过氧化物酶过多红细胞、粒细胞内的内源性过氧化物酶的含量尤其高,镜下可以识别,不要将其当成阳性结果。避免方法:石蜡切片0.3%双氧水一甲醇溶液处理切片;冰冻切片3%双氧水处理切片5-l0min。

内源性生物素可用24mg/ml的卵白素封片15 min。

常用试剂的配制

(1 )固定灌注液:4%多聚甲醛,0. 1 mol/L磷酸缓冲液(PB)Na2HPO4 . 12H2O, 27.2 g; NaH2PO4 . 2H2O, 2.8g;多聚甲醛(PFA),40g;去离子水(DDW)定溶至l000ml。

注:先称取Na2HPO4 . 12H2O,搅拌溶解,再加入多聚甲醛(PFA), 60℃加热溶解,最后加入NaH2PO4·2H2O,加去离子水至1000 ml,用NaOH调pH至7.4,过滤后保存在4℃备用。

(2) 9% NaCl溶液:NaCl, 9g,然后用双蒸水定溶至l000ml。

(3)保存液:15%或30%蔗糖溶液;0. 1 mol/L PB, pH 7.4 Na2HPO4·12H2O, 27.2 g; NaH2PO4·2H2O, 2.8g;蔗糖,300g或600g;然后用DDW定溶至l000ml。

(4)切片冻存液(l00ml ):乙醇,25. 0 ml;甘油,25 ml;0. 0l mol/L PBS,50m1。

(5) PB缓冲液:0. 1 mol/L PB, pH 7. 4 Na2HPO4·12H2O, 27.2 g; NaH2PO4·2H2O, 2.8g;然后,用双蒸水定溶至l000ml。

(6) PBS缓冲液:0. 1 mol/L PBS, pH 7. 4 Na2HPO4·12H2O,27.2 g; NaH2PO4·2H2O,2.8g; NaCl,9g;然后,用双蒸水定溶至l000ml。

注:以上两种皆为母液,使用时稀释10倍即为工作液。

(7) PBST缓冲液:0. 0lmol/L PBST, pH 7.4 0. 1 mol/L PBS, 100ml ; Triton X-100 (0.3%),3ml;然后,用双蒸水定溶至l000ml。

注:Triton X-100为一种很好的表面活性剂,也称细胞破膜剂,能溶解细胞表面的脂质,使抗体大分子物质顺利地进入细胞内。

(8) DAB显色液:DAB显色液(10 ml),pH 7.6-7.8 DAB,5 mg; H2O2(30%),5 μl;0.lmol/L PB,1ml;双蒸水,9ml。

注:DAB显色液应现用现配;防荧光淬灭剂,可从市场直接购买。

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