免疫荧光染色

(1）冰冻切片用0. 01 moUL PBST（或PBS）漂洗或冲洗3次，每次5min。

(2) 3% H2O2孵育10min，再用0. 01 mol/L PBS冲洗3次，每次5 min。

(3) 5％一8％的正常动物血清（山羊或马血清）孵育30-60min。

(4）洗掉血清，滴加一抗（0. 01 mol/L PBS配制），4℃过夜。

(5）吸出一抗，0. 01 mol/L PBS冲洗3次，每次5 min，加入荧光标记的二抗（0. 01 mol/L PBS配制），4℃过夜。

(6）吸出二抗，0. 01 mol/L PBS冲洗3次，每次 10min。

(7）封片剂封片，荧光显微镜观察照相。典型的实验结果见图20. 2B。

注意事项：

(1) 由于荧光容易淬灭，一般仅能维持几个小时，因此，荧光二抗应避光保存，即从加入荧光二抗以后的步骤中都要尽量避光操作。封片后应尽早照相，目前有市售的荧光增强剂，可使荧光在4℃保存1-2周仍不淬灭。

(2) 常用的荧光素有以下几种，绿色荧光：FITC、 Alexa Fluor 488和GFP；红色荧光：TRITC、Cy3、Alexa Fluor 568&594和MitoTrackerRed；蓝色荧光：Hoechst、DAPI；黄色荧光：YFP、Fluo-3和Rhoda-minel23等。

(3）不同的荧光素激发的波长不同，因此，选用滤光片时要注意。一般紫外线的激发波长为334-365nm，蓝光的激发波长为435-490nm，绿光的激发波长为546nm左右。

(4) 荧光显微镜应提前至少15 min打开汞灯预热。关闭30min后方可再开启。

(5）免疫荧光的组织要求很高，载玻片及盖玻片要干净无杂质。进行荧光染色时，需注意染液的pH、浓度和染色温度，还要避免对荧光有熄灭作用的物质的接触。组织和细胞也有自发荧光，如红细胞中的血红蛋白呈红色荧光，维生素A呈绿色自发性荧光等。