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高效液相色谱固定相和流动相

发布时间:2015-08-11 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1317

一 高效液相色谱固定相

色谱柱内固定相,即色谱柱填料、分离材料或分离介质是色谱分离的核心。大多数是具有高机械强度、化学稳定、耐溶剂、一定比表面积和中孔径((2-50nm),且孔径分布范围窄的微孔结构材料。根据材料的化学组成可分为无机材料、有机/无机材料和有机材料三种类型。按材料的物理结构和形状有颗粒填料和整体柱,前者有薄壳型和多孔微粒型两种。薄壳型填料粒径30-40μm,由内核为球形实心玻璃或聚合物和外壳戮结薄层多孔氧化硅、氧化铝、聚苯乙烯一二乙烯苯树脂或离子交换树脂组成,现一般用作保护柱填料,而不用于分析柱。典型多孔微粒型填料粒径1,3,5,7和10μm,其粒径分布尽可能窄。

以溶胶一凝胶法、亚微粒附聚或堆砌法制备的微粒硅胶是应用最广泛的无机微粒填料,此外是氧化锆、氧化钛、氧化铝及各种复合氧化物等。无机微粒填料本身是液固吸附色谱固定相,亦作为基质材料通过物理或化学吸附、涂渍、化学键合、包覆等方法在表面上引入薄层有机物,并对表面改性,形成有机/无机微粒填料,其中化学键合改性微粒硅胶是当今HPLC应用最多的一类固定相。有机微粒填料大体上包括葡聚糖等天然多糖经物理、化学加工得到的凝胶和以苯乙烯、二乙烯苯等单体和交联剂用化学聚合制备的交联高聚物微球。

整体柱(monolith)是20世纪80年代后期发展起来的一种整体结构分离介质,在色谱柱内在位合成,不需采用柱填充技术。一般采用正硅酸酯类、烷基硅酸酯、丙烯酰胺、N,N一亚甲基二丙烯酰胺、苯乙烯、二乙烯苯、丙烯酸酯、二甲基丙烯酸乙二酯等单体和交联剂在色谱柱内原位交联聚合形成体交联聚合物,具有微孔和穿透孔连续、整体无机或有机柱床。以正硅酸酯制备的硅胶无机整体柱,可采用类似无机微粒填料表面改性方法引进有机物形成有机/无机整体柱;也可采用正硅酸酯、烃基硅酸酯共缩聚制备有机/无机整体柱。整体柱渗透性好,可在较低柱前压操作,适用于快速分离,常规分析整体柱已商品化,也是当今毛细管液相色谱和电色谱及分离材料的前沿研究领域。

需要指出的是,尽管商品化HPLC固定相品种繁多,但大多数实验室常用的填料或色谱柱品种有限,主要是硅胶和烃基键合硅胶固定相。

二 液相色谱流动相

气相色谱中气体流动相为理想气体,其主要功能是携带试样组分通过固定相,对分离没有多少贡献和影响。相反,液相色谱流动相对分离起非常重要作用,可供选用的流动相种类亦较多,从非极性、极性有机溶剂到水溶液,可使用单一纯溶剂,也可用二元或多元混合溶剂。流动相溶剂类型和组成选择常是分离条优化的首要操作。作为液相色谱流动相的基本要求是:(1)化学惰性,不与固定相和被分离组分发生化学反应,保证柱的稳定性和分离的重现性。(2)适用的物理性质,包括沸点较低,以便于分离组分和溶剂回收;低a度,利于提高传质速率和分离速度、降低柱前压;弱或无紫外吸收等,以降低紫外吸收检测器本低响应,提高检测灵敏度;对试样具有适当溶解能力等。(3)溶剂清洗和更换方便,毒性小、纯度高、价廉等,便于操作和安全。

表征用作流动相溶剂的特征参数有沸点、相对分子质量、相对密度、黏度、介电常数、偶极矩、水溶性、折射率、紫外吸收截止波长等物理化学性质,后两者与检测器选用有关。对色谱分离来说,更重要的是与分离过程密切相关的溶剂洗脱能力或溶剂强度参数。给出常用溶剂主要特性参数,这包括;

1.溶剂强度参数ε*

定义为溶剂分子在单位吸附剂表面积上的吸附自由能,表征溶剂分子对吸附剂的亲和力大小。ε*在氧化铝吸附剂上测定的,在硅胶上的ε*约为氧化铝的0.8倍。ε*指示液固色谱中溶剂洗脱能力,ε*值愈大,对吸附剂的亲和力愈大,对溶质洗脱能力愈强。

2.溶解度参数δ

它是溶剂与溶质分子间各种作用力的总和,包括色散力、偶极作用力、接受质子能力、给予质子能力等。正相色谱中,溶剂s值愈大,其洗脱强度愈大,导致溶质保留值降低;而反相色谱中,溶剂δ愈大,其洗脱能力愈小,导致溶质保留值升高。

3.极性参数P’

表示每种溶剂与乙醇、二氧六环和硝基甲烷三种极性物质相互作用力的度量,类似于气相色谱固定液的Rohrschneider常数,反映溶剂接受质子、给出质子和偶极相互作用能力及选择性差异,亦作为表征溶剂洗脱强度的指标。正相色谱中,溶剂P’值愈大,其洗脱强度愈大,溶质保留值降低;反相色谱中,溶剂P'愈大,洗脱能力愈小,溶质保留值升高。ε0从吸附色谱中测定,δ,P’从分配色谱求出。各溶剂间ε*,δ差异与P’大致平行。

优化保留值k和分离选择性a的重要方法是改变流动相溶剂类型和组成,改变二元或多元溶剂流动相组成,对不同结构溶质,保留值降低或升高值是不一致的,不仅改变k值,而且改变a。溶剂组成优化用试差法比较麻烦、费时,成功率不一定很高。采用溶剂组成与溶剂强度参数关系的估算,可减少优化实验操作。二元混合溶剂极性参数P’与其体积组成成线性关系,可按算数平均值求出。例如溶剂A和B混合物的极性参数P’AB可按下式求出:

P’AB=φAP’A+φBP’B                                       (1-1)

式中P’A和P’B是两溶剂极性参数,φA和φB是每个溶剂的体积分数。调节P’AB很容易以改变两溶剂混合物的组成来实现。对极性吸附和正相色谱,P'与k的关系可大致用下式表示:

k2/k1=l0(P’1一P’2)/2

P’1和k1是最初溶剂强度和某溶质的k值,P’2和k2是组成改变后溶剂强度和同一溶质的k值。若P’1>P’2,则.k1<k2。粗略估算,P’改变两个单位,能导致k的10倍变化。对于反相色谱:

k2/k1=10(P’2一P'1)/2

此时若P’1>P’2,则k1>k2。如用水作流动相改为甲醇流动相,k将降低103。

假设混合一个非极性溶剂(P'≈0)A和一个极性溶剂B,得B/A混合溶剂,其溶剂强度为P',对某特定分离可获得合适k值(一般为2-5)。然而,因选择性欠佳而分离度不高,则可选用另一个极性溶剂C代替B,调节C/A组成,保持与B/A组成下的溶剂强度,基本保持k不变而提高a,以达到所需分离度。因为P’A≈0,由式(1-1)可得

φc=φB(P’B/P’C)

亦可采用ε*值来选择混合溶剂,ε*值增加0.05单位,硅胶吸附和正相色谱所有溶质k可大致降低3到4倍。然而,ε*随溶剂体积比成非线性变化,不像P’成线性变化,混合溶剂ε*值理论计算较为麻烦。

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